PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN SINH CAROTENOIDS TỪ ĐẤT RỪNG NGẬP MẶN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN SINH CAROTENOIDS TỪ ĐẤT RỪNG NGẬP MẶN VƯỜN QUỐC GIA XUÂN THỦY, NAM ĐỊNH

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh carotenoids từ đất rừng ngập mặn Vườn Quốc gia Xuân Thủy, Nam Định. Hai chủng vi khuẩn H22 và H45 có khả năng sinh carotenoids được tuyển chọn với hàm lượng carotenoids tổng số đạt lần lượt là 118 và 96 (mg/100ml dịch nuôi cấy), Đây là hai chủng vi khuẩn Gram (+), tế bào dạng que. Chủng H22 có kích thước tế bào 1,94-2,52µm ´ 0,464-0,5µm, khuẩn lạc nhỏ, tròn, có sắc tố vàng, thuộc chi Bacillus có mức độ tương đồng tới 99% với loài Bacillus marisflavi, Bacillus aqimaris.. Chủng H45 có kích thước tế bào 1,91-2,32µm ´ 0,753-0,758µm, khuẩn lạc hình elip, nhỏ, bề mặt nhẵn, bóng, dẹt khi nhìn nghiêng, có sắc tố màu đỏ.

MỞ ĐẦU

Carotenoids là sắc tố có màu vàng, đỏ, da cam có trong nhiều loại thực vật, vi sinh vật.  Các hợp chất carotenoids có nguồn gốc từ tetraterpenoid C40 có khả năng tan trong lipid đồng thời cũng là chất tiền chất của vitamin A, các chất này có ý nghĩa lớn trong y học Các hoạt chất không chỉ được tách chiết từ thực vật, từ các quá trình lên men nhờ vi sinh vật mà các chất tách chiết từ tế bào vi khuẩn đang được giới khoa học quan tâm (Rodríguez-Sáiz et al., 2007; Tuli et al., 2014). Năm 2014, Kirti và đồng tác giả đã phân lập vi khuẩn sinh carotenoids và ứng dụng của chúng đối với quá trình quang hợp ở thực vật và khả năng phòng ngừa ung thư trong y học. Rừng ngập mặn là nơi sinh sản, cung cấp nguồn sống nuôi dưỡng nhiều loại sinh vật trong từng giai đoạn phát triển hoặc suốt vòng đời của chúng. Các vi sinh vật có khả năng sinh carotenoids từ rừng ngập mặn bao gồm: nấm men, nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn. Chủng vi khuẩn sinh carotenoids bao gồm cả chủng Gram  âm và Gram dương, hiếu khí và kị khí. Tác giả Dufossé (2017) đã chỉ ra rằng các chủng sinh sắc tố phân lập từ đất và rác thải rừng ngập mặn chủ yếu là vi khuẩn Gram dương, có hình que. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh carotenoids từ đất rừng ngập mặn là có ý nghĩa trong nghiên cứu và thực tiễn. Chủng vi khuẩn sinh carotenoid thường có có bề mặt nhẵn bóng, có màu cam hoặc đỏ hoặc đỏ cam hoặc màu trắng sữa bao gồm vi khuẩn thuộc chi Halophilic và Halotolerant  (Kirti et al, 2014). Vi khuẩn sinh xanthophylls (sắc tố xanh lá cây) thường thuộc chi Exiguobacterium sp. Vi khuẩn sinh màu đỏ có nhiều trong chi Serratia như S. marcescens, S. rubidaea và S. plymuthica. Ngoài ra, chi Halobacillus có nhiều loài sinh màu cam, chi Marichromatium và Cyanobacteria cũng gồm nhiều loài có khả năng sinh sắc tố. Trong môi trường nước biển, vi khuẩn chịu ảnh hưởng của NaCl, các vi khuẩn sinh màu sắc có thể sống trong môi trường chứa 1% đến 11% NaCl và hiệu suất sinh carotenoids tốt nhất ở hầu hết các chủng với môi trường 1% NaCl (Dufossé, 2017). Chủng vi khuẩn sinh carotenoids khá đa dạng về màu sắc và hình thái tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường sống. Dưới điều kiện môi trường phù hợp với từng chủng, lượng carotenoids thường được sinh nhiều nhất trong điều kiện không có ánh sáng. Chi Bacillus.sp là chi vi khuẩn phổ biến trong nghiên cứu (Tran et al., 2016). Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh carotenoid từ đất rừng ngập mặn. Tại Việt Nam năm 2011, Vũ Thanh Thảo và đồng tác giả đã nghiên cứu tách chiết carotenoids từ vi khuẩn thuộc chi Bacillus (B. marisflavi, B. vietnamensis, B.infantis, B. licheniformis, B.indicus, B. firmus và nghiên cứu khả năng sinh màu của chủng vi khuẩn này trong các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau. Năm 2016, Truong Huynh Anh Vu đã công bố bài báo tách chiết carotenoids từ vi khuẩn Exiguobacterium indicum Pn04. Việt Nam đã có nghiên cứu bước đầu trong nuôi cấy vi khuẩn để thu hồi và tách chiết carotenoids nhưng vẫn còn ít và còn nhiều vấn đề cần nghiên cứu

Chủng vi sinh vật trong nghiên cứu đã định danh bằng phương pháp sinh học phân tử để xác định chuỗi Its của chủng vi khuẩn. Chúng tôi đã tiến hành phân lập từ mẫu đất ở vườn quốc gia Xuân Thủy, Nam Định để tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh carotenoids cao nhất.

Chọn được 7 chủng: H2, H54, H23, H36, H45, H21, H57

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu: Mẫu đất thu từ rừng ngập mặn Vườn Quốc gia Xuân Thuỷ, Giao Thuỷ, Nam Định. và các chủng vi sinh vật phân lập được.

Môi trường nuôi cấy: Môi trường Luria-Bertani (LB) đặc (g/L): pepton: 10; NaCl: 10; cao nấm men: 5; agar: 16; nước cất dẫn đến 1000mL; pH: 7. Điều chỉnh pH môi trường bằng NaCl 1M và HCl NaCl 1M. Môi trường LB lỏng có thành phần như trên những không bổ sung agar.

Phương pháp thu mẫu: Các mẫu đất được thu thập ở vị trí khác nhau của rừng ngập mặn Vườn Quốc gia Xuân Thủy, Nam Định. Dụng cụ lấy mẫu là xẻng vô trùng, gang tay, túi zip vô trùng, hộp xốp, đá gel. Lớp trên cùng của đất (dày khoảng 5 cm) đã được gạt bỏ. Đất được thu ở các độ sâu khác nhau gồm đất bề mặt và ở các độ sâu 10cm, 15cm, 20cm, 25cm, 30cm. Trong mỗi vùng, mẫu đất được thu thập từ 5 điểm khác nhau. Các mẫu được bảo quản lạnh 4°C và đưa về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập trong thời gian không quá 48 giờ kể từ thời điể thu mẫu (Mai Thị Hằng và cs., 2011).

Phân lập chủng vi sinh vật: Sử dụng phương pháp pha loãng cấy trải ở các nồng độ pha loãng từ 10^-1 đến 10^-7 Những khuẩn lạc trên môi trường phân lập có hình thái, màu sắc khác nhau được tạm coi là một chủng vi khuẩn. Các chủng này được cấy ria làm thuần chủng và đánh mã kí hiệu và được cấy chuyển giữ giống trên thạch nghiêng bảo quản ở 4°C cho các nghiên cứu tiếp theo (Mai Thị Hằng và cs 2011).

Chủng H22. Màu sắc khuẩn lạc từ vàng cam nhạt đến vàng cam đậm hơn, bề mặt khuẩn nhẵn, bóng.

Hình ảnh hiển vi là vi khuẩn gram (+), hình bầu dục.

Quan sát hình thái chủng vi khuẩn: Nuôi các chủng vi khuẩn tuyển chọn trong môi trường LB lỏng ở nhiệt độ 30°C với tốc độ 180 vòng/phút trong 72 giờ. Tiến hành lấy mẫu quan sát đặc điểm hình thái bên ngoài khuẩn lạc và mô tả các đặc điểm khuẩn lạc như hình dạng, kích thước, màu sắc, hình dạng mép, độ phồng. Sau đó tiến hành làm tiêu bản nhuộm đơn, nhuộm Gram và quan sát hình thái tế bào vi khuẩn dưới trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần và kính hiển vi điện tử quét (SEM) (Mai Thị Hằng và cs., 2011).

Tách chiết và xác định hàm lượng carotenoids tổng số: Giống vi khuẩn nghiên cứu được hoạt hoá trong môi trường LB lỏng ở nhiệt độ 30°C, nuôi lắc 180 vòng/phút. Sau 48 giờ, hút lấy 1mL dung dịch giống và xác định giá trị mật độ quang OD (optical density) ở bước sóng 600nm. Dịch nuôi cấy được pha loãng với nước cất một lần nếu cần sao cho giá trị OD của dịch giống đạt 0,1. Các ống nghiệm thí nghiệm và đối chứng là môi trường LB không bổ sung chủng giống vi khuẩn  được nuôi lắc 180 vòng/phút ở 30ºC trong 72 giờ. 1,5ml dịch mỗi mẫu được bổ sung vào ống ly tâm vô trùng và ly tâm 5000 vòng/ phút trong vòng 20 phút thu sinh khối tế bào và rửa lại bằng nước. 300µl methanol 96º lạnh ở 4ºC được bổ sung vào sinh khối, đánh đều hỗn hợp trong vòng 2 phút ở nhiệt độ phòng. Siêu âm hỗn hợp trong vòng 1 phút. bổ sung 300µl aceton lạnh ở 4ºC, vontex trong vòng 1 phút và để lạnh 4ºC trong 2 phút. Hỗn hợp được li tâm 5000 vòng/phút để thu dịch nổi. 200µl dịch thu được sử dụng để xác định độ hấp phụ ở bước sóng 475nm (Kirti et al., 2014, Blatt and Lorht, 2017).

Chủng H54. Màu sắc khuẩn màu vàng nhạt, bề mặt khuẩn nhẵn bóng 

Hình ảnh hiển vi là vi khuẩn gram (-), hình bầu dục

Xác định độ tinh sạch của carotenoids sử dụng sắc kí bản mỏng (TLC): Carotenoids được đông khô và chạy sắc ký bản mỏng, Trên các bản sắc ký mỏng silicagel Kieselgel 60 F254 (kích thước 1 x 8 (cm)) kẻ đường xuất phát cách mép dưới 1cm và đường đích cách mép trên 0.5 cm bằng bút chì. Dung môi chạy sắc ký bản mỏng được sử dụng theo tỉ lệ methanol:acetone là 1:1. Chấm mẫu phân tích: Dùng ống mao quản thủy tinh lấy mẫu và chấm lên bản mỏng tại đường xuất phát (vết chấm phải nhỏ, tròn và đều nhau, lượng chất phải đồng đều giữa các vết chấm), để khô vết chấm. Tiến hành chạy sắc kí bằng dung môi: bổ sung dung môi vào bình sắc kí với chiều cao cột dung môi dưới 1 cm, đặt bản mỏng vào bình sao cho dung môi không chạm đến vạch xuất phát và đậy kín bằng nắp thủy tinh và được giữ yên trong quá trình chạy sắc ký. Khi dung môi chạy đến vạch đích, bản mỏng được lấy ra, để khô cho bay hết dung môi. Các bản mỏng chạy sắc ký được soi dưới đèn tử ngoại UV để xác định vị trí các vạch dừng của dung môi và các vệt carotenoids và tính giá trị Rf theo công thức sau (Rebecca et al., 2014). Rf=l/l₀  hoặc Rf = v/v_o Trong đó: l là khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tâm vệt sắc ký; l₀ là khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi; v là tốc độ di chuyển của chất tan; v_o là tốc độ di chuyển của dung môi.

Chủng H45. Màu sắc khuẩn màu đỏ nhạt, bề mặt khuẩn nhẵn bóng 

Hình ảnh hiển vi là vi khuẩn gram (-), hình bầu dục

Tách chiết DNA, PCR và giải trình tự: DNA tổng số của các chủng vi khuẩn tách chiết DNA tổng số theo các bước trong bộ kit Anapure DNA mini kit của Đại học Quốc Gia Hà Nội (VNU). DNA tổng số được sử dụng để tiến hành phản ứng PCR nhằm khuếch đại đoạn trình tự 16S rDNA với cặp mồi 16SRNA27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ và 16S1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGAC-3′). Đoạn trình tự được khuếch đại theo chu kỳ nhiệt như sau: giai đoạn biến tính khởi đầu ở 94^oC trong 4 phút và tiếp theo bởi 30 chu kỳ gồm giai đoạn biến tính: 94°C trong 30 giây; giai đoạn bắt cặp ở 52°C trong 30 giây; giai đoạn kéo dài ở 72°C trong 95 giây; thời gian kéo dài chuỗi sau mỗi chu kỳ ở 72°C trong 8 phút. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di. Trình tự DNA thu được từ các mồi xuôi và ngược được dóng hàng với nhau để có được trình tự thống nhất của đoạn gen. Sau đó, trình tự đồng nhất này sẽ được sử dụng để tìm kiếm và so sánh với các trình tự tương đồng sẵn có trong ngân hàng gen (nBlast-NCBI-Mỹ). Sau khi đã có các trình tự tương đồng, các trình tự này được xử lý thành định dạng phù hợp với chương trình BioEdit.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tuyển chọn chủng vi khuẩn nghiên cứu

Sau 2 lần phân lập từ các mẫu đất ở rừng ngập mặn Vườn Quốc Xuân Thủy-Giao Thủy, Nam Định trên môi trường LB ở các độ pha loãng khác nhau, 7 chủng vi khuẩn có khuẩn lạc mang sắc tố được tuyển chọn. Khuẩn lạc của những chủng này có màu vàng, đỏ, cam, trắng sữa ở tâm có màu vàng. Các chủng này được được quy ước ký hiệu là H22, H54, H23, H36, H45, H21, H57 thu nhận ở các độ pha loãng 10^-7, 10^-3 và 10^-2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 07 chủng này được mô tả trong bảng 1.

Bảng 1: Đặc điểm hình thái của 7 chủng vi khuẩn phân lập từ đất rừng ngập mặn

Xác định carotenoids tổng số sinh bởi các chủng vi khuẩn tuyển chọn

Trong tiền thí nghiệm, 7 chủng vi khuẩn sinh carotenoids được nuôi trong môi trường LB lỏng, trong 72 giờ, lắc 200 vòng/phút ở 30˚C. Dịch nuôi cấy được sử dụng để tách chiết và xác định hàm lượng carotenoids tổng số. Carotenoids tổng số của chủng vi khuẩn được xác định bằng cách đo độ hấp phụ quang ở các bước sóng từ 200nm đến 700nm với nước nhảy là 1nm bằng máy quang phổ. Kết quả đo cho thấy tại bước sóng 475nm, carotenoids sinh bởi các chủng vi khuẩn có độ hâp phụ đạt giá trị cao nhất. Vì vậy bước sóng 475nm được lựa chọn để xác định hàm lượng carotenoids tổng số. Kết quả xác định carotenoids tổng số ở bước sóng 475nm của 7 chủng vi khuẩn phân lập được trình bày tronng hình 2. Kết quả hình 7 cho thấy chủng H45 và H22 tổng hợp được lượng carotenoids cao nhất, đạt giá trị A₄₇₅ lần lượt là 0,278 và 0,365.

Tách chiết carotenoids thô

Carotenoids thô sinh bởi hai chủng H22 và 45 được tách chiết bằng dung môi methanol : acetone với tỉ lệ 1:1 và thu nhận nhờ máy cất quay chân không  Đối với chủng H45 từ 1000mL dịch nuôi cấy thu được 96mg carotenoids thô, chủng H22 cho 118mg carotenoids thô phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

Sắc kí bản mỏng (TLC – thin layer chromatography)

Kết quả chạy sắc kí bản mỏng trên hệ dung môi là acetone: methanol (1:1) trong thời gian 10 phút thu được tại bảng 2.

Bảng 2. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng của chủng H45 và H22

Dưới ánh sáng đèn UV, các vết carotenoids tách rời nhau với khoảng cách trung bình 3,1 – 3,6cm do đó thời gian rửa giải vừa phải, hiệu quả tách chiết các chất cao. Kết quả trên tương đồng với kết quả chạy sắc kí bản mỏng TLC của Rebecca và đồng tác giả (2014). Hàm lượng carotenoids thu được từ vi khuẩn cao hơn so với lượng thu được từ thực vật. Chứng tỏ việc tách chiết carotenoids từ vi khuẩn phục vụ các ngành y dược và thực phẩm là có ý nghĩa.

Định danh chủng vi khuẩn nghiên cứu

Đặc điểm về hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn nghiên cứu

Sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường LB đặc, các đặc điểm khuẩn lạc của các chủng nghiên cứu được quan sát và thể hiện trong bảng 3.

Bảng 3. Đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc của chủng vi khuẩn sinh carotenoids

Ảnh tế bào chủng vi chủng	Dưới kính hiển vi điện tử quét

Hai chủng vi khuẩn H22 và H45 đều có khuẩn lạc tròn, nhỏ, bề mặt nhẵn, bóng, mép khuẩn lạc nhẵn,không xù xì. Chủng H22 có khuẩn lạc mày vằng, khuẩn lạc phồng, còn chủng H45 khuẩn lạc dẹt, có màu đỏ. Tế bào của hai chủng vi khuản này có dạng que và đều là vi khuẩn Gram dương. Kết quả nghiên cứu tương đồng với công bố vào năm 2016, Tác giả Dufossé (2017) báo cáo các chủng sinh sắc tố phân lập từ đất và rác thải rừng ngập mạn chủ yếu là vi khuẩn Gram dương, có hình que, có khả năng sử dụng natribenzoat.

Kết quả quan sát tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét cho thấy cả hai chủng vi khuẩn nghiên cứu đều có bề mặt nhẵn, không có lỗ. Chủng H22 có kích thước chiều dài từ 1,94-2,52 và chiều ngang 0,464 -0,5µm. Trong khi đó, chủng H45 có kích thước tế bào với chiều dài đạt 1.91-2.32 và chiều ngang là 0.753-0.758 (µm) (hình 3). Đây là hai chủng vi khuẩn Gram (+), sinh nội bào tử.

Dựa vào kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái hiển vi, siêu hiển vi và đặc điểm hình thái trên môi trường nuôi cấy, nghiên cứu giải trình tự gen để có một kết quả định loại chính xác là cần thiết.

Định loại bằng sinh học phân tử

Kết quả sau khi tách chiết DNA, chạy PCR và điện di trên agarose thu được như hình 4. Sau khi so sánh trình tự thu nhận được của đoạn gen 16S rDNA với các trình tự tương tự hoặc có liên quan chặt chẽ trong ngân hàng GenBank bằng công cụ nBlast của trang web NCBI, kết quả cho thấy rằng trình tự của chủng H22 có mức độ tương đồng tới 99% với loài Bacillus marisflavi, Bacillus aqimaris. Với kết quả này, chúng tôi xếp chủng H22 thuộc chi Bacillus. Vũ Thanh Thảo và đồng tác giả (2011) đã nghiên cứu tách chiết carotenoids từ vi khuẩn thuộc chi Bacillus sp. (B. marisflavi, B. vietnamensis, B. infantis, B. licheniformis, B. indicus, B. firmus) và nghiên cứu khả năng sinh màu của chủng vi khuẩn này trong các khoảng thời gian  nuôi cấy khác nhau. Tran và đồng tác giả (2016) tách chiết và xác định được hoạt tính chống oxy hóa của Bacillus aquimaris. Ngo và đồng tác giả đã phân lập chủng vi khuẩn sinh carotenoids là Bacillus aquimaris từ ruột tôm và ứng dụng trong làm thức ăn trong nuôi tôm vào năm 2016.

Kết quả sau khi điện di trên agarose của chủng

Kết luận

Nghiên cứu đã phân lập và tuyển chọn được 02 chủng vi khuẩn có khả năng sinh carotenoids tổng số cao nhất có ký hiệu H45 và H22, lần lượt là 96 và 118 (mg/100ml dịch nuôi cấy), từ đất rừng ngập mặn Xuân Thủy, Giao Thủy, Nam Định. Khi tách bằng sắc ký bản mỏng, các vệt carotenoids sinh bởi hai chủng H22 và H45 tách rời nhau ra với khoảng cách trung bình khoảng 3.1 đến 3.6 (cm) nên thời gian rửa giải vừa phải, hiệu quả tách các chất cao.

Chủng H22 có khuẩn lạc tròn, nhỏ, bề mặt nhẵn, bóng, nhìn nghiêng khuẩn lạc có dạng phồng, tròn nhỏ, có màu vàng. Tế bào hình que, Gram (+), kích thước tế bào 1,94-2,52µm ´ 0,464-0,5µm. Định loại bằng sinh học phân tử cho phép xếp chủng H22 thuộc chi Bacillus. Chủng H45 có khuẩn lạc hình elip, nhỏ, bề mặt nhẵn, bóng, dẹt khi nhìn nghiêng, có sắc tố màu đỏ. Tế bào dạng hình que, Gram (+). Kích thước tế bào là 1,91-2,32µm ´ 0,753-0,758µm.

Trên là đề tài nghiên cứu của Ts Phạm Thị Thủy – Viện Nghiên cứu Sinh học Ứng dụng.

THÔNG TIN LIÊN HỆ

Viện Nghiên cứu Sinh học Ứng dụng

Địa chỉ: Số 39, Ngõ 189/61, Hoàng Hoa Thám, Ngọc Hà, Quận Ba Đình, TP Hà Nội

ĐT: (+84) 2422 118 008 – (+84)962 567 869

Website: https://vbio.vn/

Email: vbiovn1@gmail.com