THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC

MỘT SỐ CHỈ DẪN CHUNG THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC

A.MỤC TIÊU
-Giới thiệu cho sinh viên nhũn” nguyên tác cơ bán khi tiến hành thực hiện thí nghiệm tại phòng thí nghiệm.

Sinh viên cần:
-Biết chuẩn bị các vật liệu, dụng cụ thực hành
-Nắm đươc nguyên tắc và cách sử dụng các dụng cụ, trang thiêt bị của phòng thí nghiệm vsv trong thực hành vsv.
-Nám đươc nguyên tác và cách tiến hanh các phương pháp vô trùng khi làm thí nghiệm trong phòng thí nghiệm vsv.

B.NỘI DUNG

I.QUY ĐỊNH TRONG KHI THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC

1.Tuyệt đối không: nói chuyện, hút thuốc, ăn uống, trang diêm trong phòng thí nghiệm. Đầu tóc phải buộc gon gàng, tránh lây nhiễm sang các thí nghiệm và tránh gíiy cháy.
2.Cần mặc áo khoác blu khi làm thí nghiệm vsv đê tránh dây vsv, hoá chất và thuốc nhuộm vào quán áo. các áo khoác này phải được giặt và khử trùng sau khi làm thí nghiệm vsv.
3.Cẩn thu dọn, lau sạch sẽ bàíỉ làm việc trước và sau khi làm việc. Lau mặt bàn bằng các chất khử trùng như 5l/t phenol hoặc l% cloramin hay cốn 70%.
4.Cần đeo găng tay cao su khi làm việc với các chất nhuộm màu, máu và các sán phẩm máu (ví dụ: dịch huyết tương, huyết thanh, kháng huyết thanh hoặc máu).
5.Khi phải dùng đến pipet hút dịch vsv, phái dùng ống bóp chuyên dụng để hút dịch nghiên cứu, không đươc hút báng miệng.
6.Các thí nghiệm có các hóa chát dòc hại hoặc khi cán đun nóng dế nhuộm tê bào phái tiến hành trong các tư hút khí dôc
7.Không được dem theo bất cư loại hóa chất và vsv nào từ phòng thí nghiệm di nơi khác sau khi rời phòng làm việc.

Các dụng cụ khác: Bình dựng nirức có vòi phun, ống Uíĩhiệm, tha Pctn (hộp lổng), bình cầu, bình nón (bình tam giác), que cây (có the sứ dụniỉ quc cày vòng, que cây móc hoặc que cày hình kim), que trang (que cat) băng thuý tinh, bong, dítu bách hương (dầu set) hoặc dầu khoáng (mineral oil), giây hoặc máy do pll,. . là những thử cần thiết cho tất cà các bài thực hành vsv.

Các hoá chất, các loại thuốc nhuộm, mỏi trường: Danh lục và cách pha chc các hoá chất, thuốc nhuộm và mòi trường cho từng bài thí nghiệm dược trình bày cụ thê ở phần phụ lục của từng bài.

II.KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC VÀ CÁCH sử DỤNG

Vì vsv quá nhỏ bé, không thè thấy bằng mắt thường nên để quan sát được chúng người ta sử dụng nhiều loại KHV khác nhau. Ở đày chỉ xin giới thiệu sơ bò về KHV quang học được dùng cho các bài thực hành vsv này. Cấu trúc và each sử các loại KHV khác (KHV đối pha, KHV nền đen, KHV huỳnh quang, KHV giao thoa và KHV điện tứ) có thể tham khảo ờ giáo trình “Vi Sinh Vật học” của Nguyễn Thành Đạt (2005); “Microbiology, 6 edition” của John Prescot Harley (2007).

Cấu tạo: KHV quang học gồm có giá kính và hệ thống quang học. Giá kính gồm chân kính, trụ mang ống kính, bàn kính, ống kính, các ốc diều chính sơ cấp (ốc thô) và thứ cấp (ốc tinh). Hộ thống quang học gồm thị kính, vật kính, tụ quang kính, hệ thông đèn chiếu sáng hoặc gương phản quang (hình 1.5).

Nguồn ánh sáng (thường là 450nm) và tụ quang kính nằm phía dưới bàn kính. Ánh sáng từ nguồn sáng được hội tụ nhờ tụ quang kính thành chùm xuyên qua lo bàn kính đến tiêu bàn dặt trên bàn kính, các thấu kính rồi đến mất người quan sát (hình 1.2). Tụ quang kính thường có màn chấn sáng, dùng để điều chính cường độ sáng.

Khi ánh sáng đi qua các vạt chai khác nhau (thúy linh, không khí…) sẽ bị khúc .xa. goi là hiên tương tán xa Đo lán xa là khá năng cùa vật chất làm ánh sáng bị khúc xa. Khá năng tán xạ cua các chat khác nhau là khác nhau. Trong KHV, khi anh sáng xuyên qua tiêu ban là thũ\ linh dó (li dcn vật kính, ánh sáng sẽ bị tán xạ bời khoáng không khí giữa vát kinh và ticu bán. Sir tán xạ này làm cho hình tinh vật the bị méo đi ít hay nhiều phụ thuộc vào độ phóng dại cùa vật kính. Độ tán xạ của kính nho khi ta sử dụng các vật kính có bội giác nhỏ hơn x40, nhưng lớn hơn rất nhicu khi sử dung các vật kính bôi giác lớn (lớn hem x40), dẫn đen hình ảnh các vât thè sẽ mờ. Vì thế, giải pháp cho vãn dé này là nhỏ các giot dầu lên tiêu bán. 

Cách sử dung kính hiển vi

Ảnh thu dược rõ hay không phụ thuộc vào nhiều yếu tó trong dó có nguồn sáng Nguồn sáng có the là ánh sáng tự nhiên (dùng gircmg phán xạ), hoặc nguon ánh sáng diên (KHV diên). Khi dà có nguồn sáng tốt có thế xem tiìêu ban
3.3.1. Xem tiéu bản ở hẹ kính khô: là khi quan sát tiêu hãn chỉ sir dung vật kính có hệ sò phóng dai < x60.

Ha tháp bàn kính, xoay mâm vật kính vể vị trí x4, hoặc xio. Đặt tiêu ban lên bàn kính, chinh vẽ vị trí cấn quan sát và hạ thấp vật kính cho gần sát vào tiêu ban Ọuan sát qua thị kính và dùng ốc thỏ de từ từ nâng vật kính lên cho tới khi nhìn thấy vùng vsv cần quan sát trên ticu ban.

– Khi dã xác định dược vị trí cần xem, dổi vật kính sang bói gtac lớn l|ĩVfi (x4(), x60), sau dó điểu chinh bang ốc thứ cáp đê thày rõ hình ành vsv

Khử trùng bằng sức nóng ướt

Plìiton<• pháp (ỉnu sói trực fiep tro/n» ntíới : khi đun sôi trong’ nước 10 – 2() phút có thế diệt hết các te hào dinh dường cua vsv kê ca virut và các bào tư không chịu nhiệt cứa nàm. một sò bào tư cua vi khuân. Tuy nhien, hầu hẽt các Hào tử chịu nhiệt của vi khuán và prion không diệt dược bâng d sôi. Phương pháp này thường sử dụng dê liệt trùng các dựng cự kim loai (kim tiêm, xi lanh,…), thức àn và dồ uốnu.

h) Phương pháp kiìừ trùm; Pa.xtơ: Đa sò các tẽ bào dinh dưỡng cua VSY lự chết khi dun ờ nhiệt dộ từ 60 – 80’‘C trong 15 – 20 phút. Bừi vậy người ta cỏ the khứ trúng ở 60’c trong 30 phút, hay ớ 70“C trong 15 phút hoặc 80’c trong 10 phút. Phương pháp khứ trừng này áp dụng cho môi trườnÜ có chứa các chất de bị báên chất dưới tác dộng cứa nhiệt dộ (ví dụ: bia, sữa, rượu vang, dam ãn…).

Sữa có thè dược khử trùng Paxtư theo hai cách: (i) khử trừng ở nhiệt dộ thiàp: dun nóng sữa ử 63 C trong 30 phút và (ii) khử trùng ờ nhiệt dỏ cao: dun nóng sữa ừ 71.7’C trong 15 giây, hoặc 88,3’T trong 1 giày (phương pháp khứ trưng o nhiei dụ cao trong thời gian ngắn).

Cách tiên hành: Trong cõng nghiệp, người ta dưa vat liệu dựng trong các banh chứa dã vò trùng vào nồi hâp ỏ 63 c trong 30 phút.

Trong dời sống hàng ngày, chúng ta có thê rót vật liệu can thanh trùng ‘Vao các dụng cụ sạch dã vò trùng băng dun sỏi 15 phút, sau dó dặt vào nỏi nưóíC ớ 63″C – 65 ’C trong 30 phút.

c) Phương ¡ỉluip khứ trùn ạ Txnihm ịPhìùmg phÓỊ) hấp Ịịián (loạn)

Nguyên lí cùa phương pháp khứ trùng Txndan là tẽ bào dinh dưỡmi cua cau’ vi khuân sinh bào tử sẽ bị chết sau khi dã bị xữ lí bã liu plurơnu pháp dun sõi. các bào tir còn sót lại dược ứ thêm một thời uian dế chúng náv mam thành các te bào diinh dưỡng, sau cỉó tiẽp tue dun sỏi de diệt các tê bào dinh dưỡnu vừa dirơc nay manu từ các bào tír chịu nhiệt này.

Cm II tien híinli: c liât eau khir 11ÜIIV dti’iK ihm SCI ỉtliu >Ï1” dùit” noi h ã P Arnol lu Kl“’ Kockl 20 pliul. sau (!ó duo’c L‘I!1 O 27 c Hong 24 ” it 1. Lap lai quy Ir’mli này 3 Lin la SÕ il) moi litron” vo liùii” l’Iniong pliup nav kliõn<Ị diel dl roi.’ call prion, lb nolle dune de khư I rim” các moi Inn II” IIIIOI ca’. Ơ Iihfrne noi khoii” CO dieu kl II SU dun” noi liãp cao áp.

lì ì k Im’ ti nri’j han ” noi ha¡> I an a Ị) I \nfan h/\ < ■ Ị

– Nem én lac cua phương pháp kluruim- bang noi cao áp là sư ket hợp ui fra tác done cua áp lire và nhiệt dô cao de neu diel \ SY (ke cá các nội bào tư chịu nhiệt cua \1 khuân ) I ron” noi hap cao áp. moi nuông bi lam nống bail” hưi nirớc bão hoà kì 11 nhiệt dò soi lòn him !(K)”(\ tao ra áp su.it lfm lum so với áp suât không khí. Lhirìnụ khư (rừng các chãt ờ 121 (. hiỉin iron” 15 – 20 phứt. Nhung khi khử trừng 11 ¡oi lượng lớn các chãt thì thòi man can keo dai him lie phán cifra cua vật liệu cũng dạt dược nhiệM do và áp sưàt này. Ví du. khi khư trim” 5 lít môi trường lòn” phai kéo rỉ ái den 7 giò. Prion bị chét khi khư trùn” lí I 34 (.2 nlm, trong 30 phứt.

– Câu trúc cua nòi hấp cao áp:

Noi hãp cao áp có nhiêu mau khác nhau SOU” ve mặt nguyên tác chứng dược Lun bang kim loai có cáu true hai lơp \o lao thành hai khoan” riêng (Hình 1.7).

Phan dá) khoan” ngoài là nơi dura Iiươc ( I ) có bõ phân dim nóng de tao hưi nUoc bão hoà tron” nổi (2). Khoan” ben tron” (3) là nơi dò các vật liệu can thanh ti ừng. có ld thôn lĩ với khoan” ngoài de cho hoi nước Um thòng giữa hai khoang, ‘liên thùng có gán van báo hiếm (4| rie dieu chinh ip suât khói vượt qưá mức cần thiet. Phía gan dáv thùng có gãn bo phàn dưa nuire vào (5) và thái nuớc ra (6) khi cán thiết. Nổi tlươc dậy và klioấ kill bail” nap (7) với các khóa xưng quanh dối X ihm từng doi mot (S).

Cách sử lý:

– Đổ nước vào nồi cao áp đen

– Xốp vặt liệu can khừ trùng vào khoang khử trùng (xcp ngay ngần, cấn t ai, không qua đày hoặc (juá chật đế hơi nước lưu thòng phàn bỏ clou tren các vật liệu khử trùng).

— Đóng nap nổi hấp, vặn chặt từng (lòi khoá đối xứng nhau tren nâp nòi.

– Cam điện nguồn.

– Đặt áp suất ờ mức cán thiết.

– Đãi thời gian khữ trùng theo ý muôn nhờ hộ thống định giờ trên nổi

– Bật công tắc trèn nồi cao áp để tiến hành khử trùng.

– Khi kim dồng hổ áp kế chí khoảng 0.2 atm, dùng van xá hết hơi nước cho den khi kim đổng hổ áp kế trỡ về sô 0 (dể loại hết không khí còn sót lại trong nói )

– Đóng van lại và đưa áp suất dến mức cần thiết, giữdii thời gian theo yèu cáu.

– Khi còi báo thời gian khử trùng kết thúc, đợi kim dó nu hổ áp kê ha xuong số 0 khoảng 5-7 phút mới mở nổi lấv vật liệu hấp ra. Nếu cẩn lấy dùng gàp. chỉnh van xả đe tỉr từ giái phóng hơi nước. Nếu xả nhanh, áp suất trong nôi sẽ dột ngột giám, làrn bật nút và chát long chứa trong các bình (do chênh lệch áp suât trong nổi với áp suất chất lỏng trong các bình nút kín).

– Rút phích diện nguồn.

* Lưu ý:

– Cách vận hành có thể có dôi chỗ khác nhau tuỳ vào mẫu của hãng sản xuất (cần đọc kỹ hướng dẫn của hãng sản xuất).

– Giữa áp suất và nhiệt độ tạo ra trong nồi có mối tương quan nhất dinh (bảng 1.2).

cm cue moi trường cỏ pH kiêm iuv avư tlìi kin khư nung pluii đõ ơ pll trung tính, (. hi dicu chinh pl ỉ s;m khi moi u none (ki khư trim;.’.

Sau khi khử trùm: cân dó moi triròng váo In .1111 ơ 24 – 4K ‘giờ dc kiếm tra do vo trùng.

1.2. Phương phap khứ trùng băng sức nóng kho

al Khư trùng hang sứt nóng í na ngon lứa I thương dùng đèn còn hoác dèn kill gar): lip dung dê khứ trùng quo city, que tramg. cac dụng cụ băng sát (kẹp. dao. kén. . ).

hì Khứ tràng hăng kill nóng khá n ong rà sav. NeLIVCI1 lí là dìimg khí nóng de dici Vac lé bào. Khá name tiei trừng cua khí nóng khó không manh bàng khí nong ifoi. VI thè’cần nhièt dó cao hơn \à thời gian lâu hon tiẽt trùng bàng khí nóng irói.

• V- • t c- c V-

Tlnêt bị tao khí nóng là lu -aiv. Phương pháp nà) dung dế tiệt trùng các vật liệu và dung cụ khò. chịu nluệt (Ihuv linh, sãt. giáv..,). không sir dung dê khir trùng chat long.

Cách tiên hành:

– Đat các dung cu cán khử trùng vào ill sãv Trước khi dem khử trùng các dung cu (dĩa Petri, que trang, ỏng nghiệm…) phai diroc bọc bâng gifiv chịu nhiệt, hoac dựng trong hóp kim loại kín, ong nghiệm dirợc Ill’ll bâng bỏng.

Đật thời gian và nhiẹt dỏ klìir trùng theo ý muòn

Khử trùng trong tú sấy thường ớ 160 IXO’C trong 2 giờ. Với nhiệt dò nàv tát ca vsv dèu bị tiêu diệt (kế cá bào tư chịu nhiệt). Nếu can khứ trùng nhanh các vặt hện thì sấy ở 190 í – 200X” tionc 6 phút dối với vật liệu không bao gói và 12 phut với vât liệu bao gói.

Sau khi khứ trùng kết thúc, dè nguội dẽn 60 c I11ỚI lấv dụng cụ ra de tránh vỏ các do thiiy tinh do clienh lẹch nhiệt dó dot ngot.

MỜI CÁC BẠN XEM CHI TIẾT TRONG CÁC FILE DƯỚI ĐÂY

Viện Nghiên cứu Sinh học Ứng dụng
Địa chỉ: Số 39, Ngõ 189/61, Hoàng Hoa Thám, Ngọc Hà, Quận Ba Đình, TP Hà Nội
ĐT: (+84) 2422 118 008 – (+84)962 567 869
Website: https://vbio.vn/
Email: vbiovn1@gmail.com